H9c2（2-1）是由B.Kimes和B.Brandt從胚胎BD1X大鼠心臟組織衍生的原始克隆細(xì)胞系的亞克隆，并且表現(xiàn)出骨骼肌的許多特性。該系中的成肌細(xì)胞將融合形成多核肌管并響應(yīng)乙酰膽堿刺激。如果培養(yǎng)基中的血清濃度降至1％，則融合發(fā)生得更快。

　　一、大鼠心肌細(xì)胞H9C2試劑配制：

　?。?）PBS磷酸鹽緩沖液：PBS粉劑每袋加ddH2O定容至1000mL，調(diào)pH7.2，121℃，30min高壓滅菌，4℃冰箱保存。

　?。?）DMEM-F12細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液：臨用前根據(jù)需要按體積比10%加胎牛血清，最后按1％體積分?jǐn)?shù)加入雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素)，使青霉素和鏈霉素的終濃度分別為100U/mL和100U/mL，置于4℃冰箱保存。

　　(3)心肌細(xì)胞培養(yǎng)基：DMEM/F12+10%胎牛血清（Hyclone）+1%雙抗+Brdu(終濃度為0.1mmol/L)，0.2um一次性過(guò)濾器過(guò)濾除菌，制備100ml，現(xiàn)配先用。

　?。?）0.125%胰酶消化液：將實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的0.25%胰酶消化液用蒸餾水稀釋2倍。

　　二、大鼠心肌細(xì)胞H9C2實(shí)驗(yàn)步驟：

　?。?）取出生7d內(nèi)新生乳大鼠，燒杯裝載放入細(xì)胞間，另準(zhǔn)備75%酒精，先用鑷子使乳鼠頸部脫臼致死，在75%酒精中浸泡至少1min，然后固定在泡沫板上，先用碘酒消毒胸腹部，再用酒精消毒。取出無(wú)菌剪刀和鑷子，先用酒精棉球再次消毒，剪開胸，取心尖部位，快速置于含雙抗的預(yù)冷的PBS溶液潤(rùn)洗3次。

　?。?）剔除周圍結(jié)締組織，將心臟置于無(wú)菌平皿中，將心臟盡量剪碎，平皿內(nèi)加入適量0.125%的胰酶，在37℃培養(yǎng)箱中，采用分次消化，每次消化5min，一共消化8-10次。

　?。?）每次消化后取上清液，并加入等量的含10%的DMEM/F12培養(yǎng)基，輕輕混勻，中和胰酶的消化，防止消化過(guò)度。用200目細(xì)胞過(guò)濾篩子過(guò)濾含細(xì)胞的混合液，最后將過(guò)濾后的細(xì)胞懸液1000rpm離心5min。離心后收集沉淀，用PBS再次重復(fù)離心3次。用細(xì)胞培養(yǎng)基將細(xì)胞沉淀重懸，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

　　（4）培養(yǎng)90min左右，將未貼壁的細(xì)胞懸液吸出。此時(shí)已經(jīng)貼壁的是心肌成纖維細(xì)胞。

　?。?）將未貼壁的細(xì)胞懸液放入新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，并每日觀察心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)。