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介紹大鼠心肌細(xì)胞H9C2的試劑配制及實(shí)驗(yàn)步驟

更新時(shí)間:2021-12-26  |  點(diǎn)擊率:1441
  H9c2(2-1)是由B.Kimes和B.Brandt從胚胎BD1X大鼠心臟組織衍生的原始克隆細(xì)胞系的亞克隆,并且表現(xiàn)出骨骼肌的許多特性。該系中的成肌細(xì)胞將融合形成多核肌管并響應(yīng)乙酰膽堿刺激。如果培養(yǎng)基中的血清濃度降至1%,則融合發(fā)生得更快。
  一、大鼠心肌細(xì)胞H9C2試劑配制:
 ?。?)PBS磷酸鹽緩沖液:PBS粉劑每袋加ddH2O定容至1000mL,調(diào)pH7.2,121℃,30min高壓滅菌,4℃冰箱保存。
 ?。?)DMEM-F12細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液:臨用前根據(jù)需要按體積比10%加胎牛血清,最后按1%體積分?jǐn)?shù)加入雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素),使青霉素和鏈霉素的終濃度分別為100U/mL和100U/mL,置于4℃冰箱保存。
  (3)心肌細(xì)胞培養(yǎng)基:DMEM/F12+10%胎牛血清(Hyclone)+1%雙抗+Brdu(終濃度為0.1mmol/L),0.2um一次性過(guò)濾器過(guò)濾除菌,制備100ml,現(xiàn)配先用。
 ?。?)0.125%胰酶消化液:將實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的0.25%胰酶消化液用蒸餾水稀釋2倍。
  二、大鼠心肌細(xì)胞H9C2實(shí)驗(yàn)步驟:
 ?。?)取出生7d內(nèi)新生乳大鼠,燒杯裝載放入細(xì)胞間,另準(zhǔn)備75%酒精,先用鑷子使乳鼠頸部脫臼致死,在75%酒精中浸泡至少1min,然后固定在泡沫板上,先用碘酒消毒胸腹部,再用酒精消毒。取出無(wú)菌剪刀和鑷子,先用酒精棉球再次消毒,剪開胸,取心尖部位,快速置于含雙抗的預(yù)冷的PBS溶液潤(rùn)洗3次。
 ?。?)剔除周圍結(jié)締組織,將心臟置于無(wú)菌平皿中,將心臟盡量剪碎,平皿內(nèi)加入適量0.125%的胰酶,在37℃培養(yǎng)箱中,采用分次消化,每次消化5min,一共消化8-10次。
 ?。?)每次消化后取上清液,并加入等量的含10%的DMEM/F12培養(yǎng)基,輕輕混勻,中和胰酶的消化,防止消化過(guò)度。用200目細(xì)胞過(guò)濾篩子過(guò)濾含細(xì)胞的混合液,最后將過(guò)濾后的細(xì)胞懸液1000rpm離心5min。離心后收集沉淀,用PBS再次重復(fù)離心3次。用細(xì)胞培養(yǎng)基將細(xì)胞沉淀重懸,接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
  (4)培養(yǎng)90min左右,將未貼壁的細(xì)胞懸液吸出。此時(shí)已經(jīng)貼壁的是心肌成纖維細(xì)胞。
 ?。?)將未貼壁的細(xì)胞懸液放入新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng),并每日觀察心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)。